:: Travail de fin d'études 1999 ::.

:: DEC Génie Biomédical (UCL - Belgique) ::.

Cytotoxicité des allogreffes de Fascia Lata après sécurisation :
Evaluation de la cytotoxicité et mise au point d'une méthode d'évaluation quantitative par ordinateur

Mémoire présenté par:
Ing. Tanguy Verraes en vue de l'obtention du diplôme d'études complémentaires en sciences naturelles appliquées.
Orientation : Génie Biomédical.

Directeurs de mémoire:
Professeur Schneider - Département de chimie (CHIM - UCL) ; Unité de biochimie (BIOC)
Docteur Cornu - Département de chirurgie (CHIR - UCL) ; Unité de chirurgie orthopodique (ORTO)

Président du jury:
Professeur Rouxhet - Département de chimie appliquée et des bio-industries (CABI - UCL) ; Unité de chimie des interfaces (CIFA)

Membres du jury:
Professeur Lison - Ecole de Santé Publique (ESP - UCL) ; Unité de toxicologie industrielle et de médecine du travail (TOXI)
Professeur Remacle - Département de biologie (BIOL - UCL) ; Unité de biologie animale (BANI)
Docteur Vanderkelen - Hôpital Militaire de Bruxelles - Centre des brûlés ; European Homograft Bank (EHB)

Université catholique de Louvain
Institut interfacultaire des sciences - INIS
Louvain-La-Neuve - AOÛT 1999

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Remerciements

Au Professeur Yves-Jacques Schneider, responsable de l'unité de biochimie, pour son accueil, ses conseils, son temps précieux et ses compétences en biochimie et en culture cellulaire.
Au Docteur Olivier Cornu de l'unité de chirurgie orthopédique des Cliniques universitaires Saint-Luc à Bruxelles pour avoir gentiment accepté d'être promoteur, ses conseils, ses compétences en matière de greffes et son temps précieux consacré à la correction du mémoire.
Au personnel - assistants et doctorands - du laboratoire de biochimie cellulaire pour le bon accueil, la bonne ambiance et leur bonne humeur au sein du laboratoire.
Aux Professeurs R. Crichton - laboratoire de biochimie - et Cl. Remacle - responsable de l'unité de biologie animale - pour l'utilisation de leur matériel.
Aux membres du jury qui ont accepté, malgré un emploi du temps très chargé, de faire partie du jury.
A ceux et celles qui ont, de près ou de loin, contribuer à ce travail.
Je tiens à remercier en particulier Mme Geneviève Schmitz-Drevillon du laboratoire de biochimie cellulaire pour son extrême gentillesse, son temps et sa disponibilité, ses précieux conseils et ses compétences au niveau de la culture cellulaire. Personne sans qui de nombreuses manipulations n'auraient pu se dérouler sans problèmes. Merci.
Je ne voudrais surtout pas oublier Denis Dufrane, Etudiant chercheur en 3ème doctorat en Sciences médicales, qui fut, tout au long de ce travail, un précieux collaborateur plein de bonne humeur. Son aide a été inestimable pour la littérature sur la cytotoxicité, la fourniture des greffons, leur traitement, le choix des tests et l'analyse des résultats.
Un grand merci à Monsieur Simon-Pierre Nothomb et à mes nombreux amis pour m'avoir supporté ...
Je dédie ce travail à mes parents qui m'ont supporté et soutenu tout au long de cette année d'étude.

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Table des matières

I. Introduction
1. Allogreffe
1.1. Greffon 'vascularisé' : HLA et Rhésus ABO
1.2. Greffon 'non vascularisé
2. Greffon : Fascia lata
2.1. Traitement préparatoire du Fascia lata
3. Site d'implantation : Dure-mère
3.1. Dure-mère périostée
3.2. Dure-mère méningée
4. Biocompatibilité
4.1. Nécrose et Apoptose
4.1.A. Nécrose ou mort cellulaire "accidentelle"
4.1.B. Apoptose ou mort cellulaire "programmée"
4.2. Tests de cytotoxicité in vitro
4.2.A. Normes ISO
4.2.A.1. Contrôles positif et négatif
4.2.A.2. Conditions d'extraction
4.2.A.3. Choix des lignées cellulaires et du milieu
4.2.A.4. Procédure de test
4.2.B. Méthode d'évaluation de la cytotoxicité
4.2.B.1. Principaux critères d'évaluation in vitro de la cytotoxicité
4.3. Evaluation qualitative de la cytotoxicité
4.3.A. Test de confluence - Coloration histologique
4.4. Evaluation quantitative de la cytotoxicité
4.4.A. MTT
4.4.B. Rouge neutre
4.4.C. Lactate déshydrogénase (LDH)
4.4.D. Synthèse d'ADN
4.4.E. Intégrité membranaire
4.4.F. Test d'exclusion au Bleu de Trypan
4.4.G. Test de diffusion à l'Agar
4.4.H. Glutathion (GSH)
4.5. La spectrophotométrie
4.5.A. Sources d'erreurs possibles
5. La culture cellulaire in vitro
5.1. Conditions de culture
5.1.A. Milieux de culture
5.1.B. Sérum
5.1.C. Stérilité
5.1.D. Température
5.1.E. Support
5.2. Culture cellulaire stationnaire
5.2.A. Les avantages de la culture
5.2.B. Les inconvénients de la culture
5.3. La croissance cellulaire
5.3.A. La phase "Lag"
5.3.B. La phase "Log"
5.3.C. Le "plateau"
5.4. Les limitations des méthodes in vitro

II. Objectif du travail
1. Evaluation de la cytotoxicité du Fascia Lata sécurisé
2. Méthode informatisée d'évaluation quantitative
2.1. L'analyse d'image par ordinateur

III. Matériel et Méthodes
1. Le Fascia lata
1.1. Traitement préparatoire du fascia lata
1.1.A. Protocole 5
1.1.B. Protocole 5'
1.1.C. Protocole 5''
1.1.D. Protocole 6
1.2. Traitement préparatoire des os
1.2.A. Protocole des os
1.3. Stérilisation et lyophilisation
2. Culture cellulaire
2.1. Lignées Cellulaires
2.1.A. WI-38 - Fibroblastes
2.1.B. NEURO2A - Neuroblastes
2.2. Milieux de culture
2.2.A. FBS - Fetal Bovine Serum
2.2.B. L-Glutamine
2.2.C. Dulbecco's Modified Eagle's Medium - DMEM
2.2.C.1. Bio-Whittaker - Boehringer Ingelheim GmbH
2.2.C.2. GibcoBRL - Life Technologies ltd
2.2.D. HAM'S F-12
2.2.D.1. Bio-Whittaker - Boehringer Ingelheim GmbH
2.2.D.2. GibcoBRL - Life Technologies ltd.
2.3. Produits
2.3.A. Phosphate Buffered Saline solution - PBS
2.3.B. Trypsine
2.4. Matériel technique
2.4.A. Flacon pour culture
2.4.B. Plaque pour culture de tissus
2.4.B.1. Falcon® - Becton Dickinson & Company
2.4.B.2. Cellstar® - Greiner Labortechnik
2.4.C. Centrifugeuse
2.4.D. Incubateur
2.4.D.1. Spécifications techniques de l'incubateur CO27
3. Comptage cellulaire : Hémocytomètre
3.1. Trypan Blue solution
3.2. Méthode
4. Matériel optique
4.1. Microscope photonique
4.2. Système Photo
5. Milieu d'extraction
5.1. Conditions d'extraction
5.1.A. Prescrits ISO 10993-5
5.1.B. Conditions de travail
6. Evaluation quantitative de la cytotoxicité
6.1. Test au MTT
6.1.A. Matériel
6.1.A.1. Thiazolyl Blue - MTT
6.1.A.2. DMSO : Diméthyl sulfoxide
6.1.B. Méthode
6.1.C. Disposition sur la microplaque
6.1.D. Expression des résultats
6.2. Test au Rouge neutre
6.2.A. Matériel
6.2.A.1. Rouge neutre
6.2.A.2. Solution stock de rouge neutre
6.2.B. Méthode
6.2.C. Disposition sur la microplaque
6.2.D. Expression des résultats
7. Lecteur Microplaque
7.1. Spécifications techniques du "Benchmark Microplate Reader"
7.2. Expression des résultats
8. Morphométrie - Coloration histologique
8.1. Matériel
8.1.A. Solution de Bouin
8.1.B. Bleu de Coomassie
8.1.C. Décolorant Coomassie
8.1.D. Phénol
8.2. Méthode
8.2.A. Test sur milieu d'extraction
8.2.B. Contrôle négatif (réponse non cytotoxique)
8.2.C. Contrôle positif (réponse cytotoxique)
8.2.D. Coloration histologique au bleu de Coomassie
8.3. Expression des résultats
9. Test d'évaluation quantitative par ordinateur
9.1. Matériel
9.1.A. Solution de Bouin
9.1.B. Bleu de Coomassie
9.1.C. Décolorant Coomassie
9.1.D. Phénol
9.1.E. Partie optique - Photo
9.1.F. Partie informatique - ordinateur
9.2. Méthode
9.3. Expression des résultats
9.3.A. Exemple
10. Traitement statistique
10.1. ECARTYPE (nombre1 ; nombre2 ; ...)
10.2. INTERVALLE.CONFIANCE (a ; standard_dev ; taille)
10.3. COEFFICIENT.CORRELATION (matrice1 ; matrice2)

IV. Résultats
1. Test quantitatif : MTT
1.1. Conditions opératoires
1.2. Greffon : Os
1.3. Greffon : Fascia Lata
2. Test quantitatif : Rouge neutre
2.1. Conditions opératoires
2.2. Greffon : Os
2.3. Greffon : Fascia Lata
3. Corrélation entre MTT / Rouge neutre
4. Test qualitatif : Morphométrie
4.1. Conditions opératoires
4.2. Os - Lot A / Lot B
4.3. Fascia Lata - Protocole 5 / Protocole 6
4.4. Corrélation entre évaluateurs
5. Test quantitatif : Méthode informatisée
5.1. Os - Lot A / Lot B
5.2. Fascia Lata : Protocole 5 / Protocole 6
5.3. Fascia Lata : Protocole 5 / Protocole 5''
5.4. Fascia Lata : Protocole 5 / Protocole 5'
6. Corrélation entre Test Qualitatif / Méthode informatisée
7. Corrélation entre tests MTT, Rouge neutre et Méthode informatisée

V. Discussion et perspectives
1. Greffon : Os
1.1. Os : conclusion
2. Greffon : Fascia Lata
2.1. Protocole 5
2.2. Protocole 5'
2.3. Protocole 5''
2.4. Protocole 6
2.5. Conclusion
3. Tests MTT / Rouge neutre
4. Morphométrie
5. Méthode informatisée : "Image Analysis"

Conclusion

Données expérimentales
1. Tests quantitatifs : MTT
1.1. Os - Lot A
1.2. Os - Lot B
1.3. Fascia Lata - Protocole 5
1.4. Fascia Lata - Protocole 5'
2. Test quantitatif : Rouge neutre
2.1. Os - Extraction : 0.1 g/ml
2.2. Os - Extraction : 0.2 g/ml
2.3. Fascia Lata - Protocole 5
2.4. Fascia Lata - Protocole 5'
3. Test qualitatif : Morphométrie
3.1. Os - Lot A
3.2. Os - Lot B
3.3. Fascia Lata - Protocole 5
3.4. Fascia Lata - Protocole 6
4. Test quantitatif : Méthode informatisée
4.1. Os - Lot A / Lot B
4.2. Fascia Lata : Protocole 5 / Protocole 6
4.3. Fascia Lata : Protocole 5 / Protocole 5''
4.4. Fascia Lata : Protocole 5 / Protocole 5'

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