:: Travail de fin d'?tudes 1999 ::.

:: DEC G?nie Biom?dical (UCL - Belgique) ::.

Cytotoxicit? des allogreffes de Fascia Lata apr?s s?curisation :
Evaluation de la cytotoxicit? et mise au point d'une m?thode d'?valuation quantitative par ordinateur

M?moire pr?sent? par:
Ing. Tanguy Verraes en vue de l'obtention du dipl?me d'?tudes compl?mentaires en sciences naturelles appliqu?es.
Orientation : G?nie Biom?dical.

Directeurs de m?moire:
Professeur Schneider - D?partement de chimie (CHIM - UCL) ; Unit? de biochimie (BIOC)
Docteur Cornu - D?partement de chirurgie (CHIR - UCL) ; Unit? de chirurgie orthopodique (ORTO)

Pr?sident du jury:
Professeur Rouxhet - D?partement de chimie appliqu?e et des bio-industries (CABI - UCL) ; Unit? de chimie des interfaces (CIFA)

Membres du jury:
Professeur Lison - Ecole de Sant? Publique (ESP - UCL) ; Unit? de toxicologie industrielle et de m?decine du travail (TOXI)
Professeur Remacle - D?partement de biologie (BIOL - UCL) ; Unit? de biologie animale (BANI)
Docteur Vanderkelen - H?pital Militaire de Bruxelles - Centre des br?l?s ; European Homograft Bank (EHB)

Universit? catholique de Louvain
Institut interfacultaire des sciences - INIS
Louvain-La-Neuve - AO?T 1999

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Remerciements

Au Professeur Yves-Jacques Schneider, responsable de l'unit? de biochimie, pour son accueil, ses conseils, son temps pr?cieux et ses comp?tences en biochimie et en culture cellulaire.
Au Docteur Olivier Cornu de l'unit? de chirurgie orthop?dique des Cliniques universitaires Saint-Luc ? Bruxelles pour avoir gentiment accept? d'?tre promoteur, ses conseils, ses comp?tences en mati?re de greffes et son temps pr?cieux consacr? ? la correction du m?moire.
Au personnel - assistants et doctorands - du laboratoire de biochimie cellulaire pour le bon accueil, la bonne ambiance et leur bonne humeur au sein du laboratoire.
Aux Professeurs R. Crichton - laboratoire de biochimie - et Cl. Remacle - responsable de l'unit? de biologie animale - pour l'utilisation de leur mat?riel.
Aux membres du jury qui ont accept?, malgr? un emploi du temps tr?s charg?, de faire partie du jury.
A ceux et celles qui ont, de pr?s ou de loin, contribuer ? ce travail.
Je tiens ? remercier en particulier Mme Genevi?ve Schmitz-Drevillon du laboratoire de biochimie cellulaire pour son extr?me gentillesse, son temps et sa disponibilit?, ses pr?cieux conseils et ses comp?tences au niveau de la culture cellulaire. Personne sans qui de nombreuses manipulations n'auraient pu se d?rouler sans probl?mes. Merci.
Je ne voudrais surtout pas oublier Denis Dufrane, Etudiant chercheur en 3?me doctorat en Sciences m?dicales, qui fut, tout au long de ce travail, un pr?cieux collaborateur plein de bonne humeur. Son aide a ?t? inestimable pour la litt?rature sur la cytotoxicit?, la fourniture des greffons, leur traitement, le choix des tests et l'analyse des r?sultats.
Un grand merci ? Monsieur Simon-Pierre Nothomb et ? mes nombreux amis pour m'avoir support? ...
Je d?die ce travail ? mes parents qui m'ont support? et soutenu tout au long de cette ann?e d'?tude.

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Table des mati?res

I. Introduction
1. Allogreffe
1.1. Greffon 'vascularis?' : HLA et Rh?sus ABO
1.2. Greffon 'non vascularis?
2. Greffon : Fascia lata
2.1. Traitement pr?paratoire du Fascia lata
3. Site d'implantation : Dure-m?re
3.1. Dure-m?re p?riost?e
3.2. Dure-m?re m?ning?e
4. Biocompatibilit?
4.1. N?crose et Apoptose
4.1.A. N?crose ou mort cellulaire "accidentelle"
4.1.B. Apoptose ou mort cellulaire "programm?e"
4.2. Tests de cytotoxicit? in vitro
4.2.A. Normes ISO
4.2.A.1. Contr?les positif et n?gatif
4.2.A.2. Conditions d'extraction
4.2.A.3. Choix des lign?es cellulaires et du milieu
4.2.A.4. Proc?dure de test
4.2.B. M?thode d'?valuation de la cytotoxicit?
4.2.B.1. Principaux crit?res d'?valuation in vitro de la cytotoxicit?
4.3. Evaluation qualitative de la cytotoxicit?
4.3.A. Test de confluence - Coloration histologique
4.4. Evaluation quantitative de la cytotoxicit?
4.4.A. MTT
4.4.B. Rouge neutre
4.4.C. Lactate d?shydrog?nase (LDH)
4.4.D. Synth?se d'ADN
4.4.E. Int?grit? membranaire
4.4.F. Test d'exclusion au Bleu de Trypan
4.4.G. Test de diffusion ? l'Agar
4.4.H. Glutathion (GSH)
4.5. La spectrophotom?trie
4.5.A. Sources d'erreurs possibles
5. La culture cellulaire in vitro
5.1. Conditions de culture
5.1.A. Milieux de culture
5.1.B. S?rum
5.1.C. St?rilit?
5.1.D. Temp?rature
5.1.E. Support
5.2. Culture cellulaire stationnaire
5.2.A. Les avantages de la culture
5.2.B. Les inconv?nients de la culture
5.3. La croissance cellulaire
5.3.A. La phase "Lag"
5.3.B. La phase "Log"
5.3.C. Le "plateau"
5.4. Les limitations des m?thodes in vitro

II. Objectif du travail
1. Evaluation de la cytotoxicit? du Fascia Lata s?curis?
2. M?thode informatis?e d'?valuation quantitative
2.1. L'analyse d'image par ordinateur

III. Mat?riel et M?thodes
1. Le Fascia lata
1.1. Traitement pr?paratoire du fascia lata
1.1.A. Protocole 5
1.1.B. Protocole 5'
1.1.C. Protocole 5''
1.1.D. Protocole 6
1.2. Traitement pr?paratoire des os
1.2.A. Protocole des os
1.3. St?rilisation et lyophilisation
2. Culture cellulaire
2.1. Lign?es Cellulaires
2.1.A. WI-38 - Fibroblastes
2.1.B. NEURO2A - Neuroblastes
2.2. Milieux de culture
2.2.A. FBS - Fetal Bovine Serum
2.2.B. L-Glutamine
2.2.C. Dulbecco's Modified Eagle's Medium - DMEM
2.2.C.1. Bio-Whittaker - Boehringer Ingelheim GmbH
2.2.C.2. GibcoBRL - Life Technologies ltd
2.2.D. HAM'S F-12
2.2.D.1. Bio-Whittaker - Boehringer Ingelheim GmbH
2.2.D.2. GibcoBRL - Life Technologies ltd.
2.3. Produits
2.3.A. Phosphate Buffered Saline solution - PBS
2.3.B. Trypsine
2.4. Mat?riel technique
2.4.A. Flacon pour culture
2.4.B. Plaque pour culture de tissus
2.4.B.1. Falcon? - Becton Dickinson & Company
2.4.B.2. Cellstar? - Greiner Labortechnik
2.4.C. Centrifugeuse
2.4.D. Incubateur
2.4.D.1. Sp?cifications techniques de l'incubateur CO27
3. Comptage cellulaire : H?mocytom?tre
3.1. Trypan Blue solution
3.2. M?thode
4. Mat?riel optique
4.1. Microscope photonique
4.2. Syst?me Photo
5. Milieu d'extraction
5.1. Conditions d'extraction
5.1.A. Prescrits ISO 10993-5
5.1.B. Conditions de travail
6. Evaluation quantitative de la cytotoxicit?
6.1. Test au MTT
6.1.A. Mat?riel
6.1.A.1. Thiazolyl Blue - MTT
6.1.A.2. DMSO : Dim?thyl sulfoxide
6.1.B. M?thode
6.1.C. Disposition sur la microplaque
6.1.D. Expression des r?sultats
6.2. Test au Rouge neutre
6.2.A. Mat?riel
6.2.A.1. Rouge neutre
6.2.A.2. Solution stock de rouge neutre
6.2.B. M?thode
6.2.C. Disposition sur la microplaque
6.2.D. Expression des r?sultats
7. Lecteur Microplaque
7.1. Sp?cifications techniques du "Benchmark Microplate Reader"
7.2. Expression des r?sultats
8. Morphom?trie - Coloration histologique
8.1. Mat?riel
8.1.A. Solution de Bouin
8.1.B. Bleu de Coomassie
8.1.C. D?colorant Coomassie
8.1.D. Ph?nol
8.2. M?thode
8.2.A. Test sur milieu d'extraction
8.2.B. Contr?le n?gatif (r?ponse non cytotoxique)
8.2.C. Contr?le positif (r?ponse cytotoxique)
8.2.D. Coloration histologique au bleu de Coomassie
8.3. Expression des r?sultats
9. Test d'?valuation quantitative par ordinateur
9.1. Mat?riel
9.1.A. Solution de Bouin
9.1.B. Bleu de Coomassie
9.1.C. D?colorant Coomassie
9.1.D. Ph?nol
9.1.E. Partie optique - Photo
9.1.F. Partie informatique - ordinateur
9.2. M?thode
9.3. Expression des r?sultats
9.3.A. Exemple
10. Traitement statistique
10.1. ECARTYPE (nombre1 ; nombre2 ; ...)
10.2. INTERVALLE.CONFIANCE (a ; standard_dev ; taille)
10.3. COEFFICIENT.CORRELATION (matrice1 ; matrice2)

IV. R?sultats
1. Test quantitatif : MTT
1.1. Conditions op?ratoires
1.2. Greffon : Os
1.3. Greffon : Fascia Lata
2. Test quantitatif : Rouge neutre
2.1. Conditions op?ratoires
2.2. Greffon : Os
2.3. Greffon : Fascia Lata
3. Corr?lation entre MTT / Rouge neutre
4. Test qualitatif : Morphom?trie
4.1. Conditions op?ratoires
4.2. Os - Lot A / Lot B
4.3. Fascia Lata - Protocole 5 / Protocole 6
4.4. Corr?lation entre ?valuateurs
5. Test quantitatif : M?thode informatis?e
5.1. Os - Lot A / Lot B
5.2. Fascia Lata : Protocole 5 / Protocole 6
5.3. Fascia Lata : Protocole 5 / Protocole 5''
5.4. Fascia Lata : Protocole 5 / Protocole 5'
6. Corr?lation entre Test Qualitatif / M?thode informatis?e
7. Corr?lation entre tests MTT, Rouge neutre et M?thode informatis?e

V. Discussion et perspectives
1. Greffon : Os
1.1. Os : conclusion
2. Greffon : Fascia Lata
2.1. Protocole 5
2.2. Protocole 5'
2.3. Protocole 5''
2.4. Protocole 6
2.5. Conclusion
3. Tests MTT / Rouge neutre
4. Morphom?trie
5. M?thode informatis?e : "Image Analysis"

Conclusion

Donn?es exp?rimentales
1. Tests quantitatifs : MTT
1.1. Os - Lot A
1.2. Os - Lot B
1.3. Fascia Lata - Protocole 5
1.4. Fascia Lata - Protocole 5'
2. Test quantitatif : Rouge neutre
2.1. Os - Extraction : 0.1 g/ml
2.2. Os - Extraction : 0.2 g/ml
2.3. Fascia Lata - Protocole 5
2.4. Fascia Lata - Protocole 5'
3. Test qualitatif : Morphom?trie
3.1. Os - Lot A
3.2. Os - Lot B
3.3. Fascia Lata - Protocole 5
3.4. Fascia Lata - Protocole 6
4. Test quantitatif : M?thode informatis?e
4.1. Os - Lot A / Lot B
4.2. Fascia Lata : Protocole 5 / Protocole 6
4.3. Fascia Lata : Protocole 5 / Protocole 5''
4.4. Fascia Lata : Protocole 5 / Protocole 5'

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